Miles Morales, Teenager aus Brooklyn mit afroamerikanischen und puerto-ricanischen Wurzeln, fällt es schwer, sich in einer neuen Privatschule in Manhattan einzugliedern. Er möchte lieber Zeit mit seinen Freunden aus der Nachbarschaft oder mit seinem Onkel Aaron verbringen, der in den Graffitikünsten des Jungen grosses Potenzial sieht. Miles vergöttert Aaron.

Doch der Onkel ist eine recht vielschichtige Persönlichkeit, die in der Vergangenheit in Konflikt mit dem Gesetz geraten ist. Das Leben von Miles wird noch komplizierter, als er von einer radioaktiven Spinne gebissen wird. Er entwickelt Superkräfte wie einen Spinnensinn oder ein Supergehör, er kann mit der Umgebung verschmelzen, an Objekten kleben und vieles mehr.

Derweil hat Kingpin, das ruchlose kriminelle Superhirn der Stadt, einen ultrageheimen nuklearen Supercollider entwickelt, der ein Portal zu anderen Universen öffnet und verschiedene Versionen von Spider-Man (darunter einen älteren Peter Parker, Spider-Gwen, Spider-Man Noir, Spider-Ham und Anime-Heldin Peni Parker) in die Welt von Miles bringt.